PCR - der DNA Copy-Shop

  • "Jack the Ripper durch Speicheltest überführt", hätte der Aufmacher einer Londonder Zeitung lauten können, wäre Scotland Yard 1888 in der Lage gewesen, die Methoden der Gentechnik zu nutzen. Bereits Zellpartikel enthalten Reste von DNA, die ausreichen, um vom Täter einen "genetischen Fingerabdruck " zu erstellen. Die Biochemiker benötigen dafür große Mengen Täter-DNA , die sie mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction, PCR) millionenfach vervielfältigen, um sie anschließend analysieren zu können.
  • Genutzt wird das Prinzip der Replikation: Vervielfachung durch zyklische Wiederholung der Replikation.
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Worum gehts?

 

Vorgestellt wird ein Verfahren, um unter Laborbedingungen DNA in notwendigen Mengen herzustellen. Die PCR ist ein Standardverfahren in der Biotechnologie (Gentechnologie).

Voraussetzung

DNA - Eigenschaften

  • Da die Einzelstränge der DNA über Wasserstoffbrücken miteinander verbunden sind (komplementäre Basenpaarung), müssen sie voneinander getrennt werden.
  • Einzelstränge werden durch Erhitzen erzeugt, sie trennen sich bei Temperaturen zwischen 70 und 100°C (Schmelzpunkt). Die Aufrennung durch Enzyme wäre zu aufwendig.
  • Die DNA liegt anschließend als Einzelstrangmolekül (Matrizenstrang) vor. Das Ablesen ist nun möglich.

Primer

  • Primer sind synthetisch hergestellte Startermoleküle aus 15 - 20 Nukleotiden, die die Anlagerungerung der DNA - Polymerase ermöglichen.
  • Sie wirken paarweise in entgegengesetzte Richtung.

Taq - Polymerase statt DNA - Polymerase

  • Aufgrund des Schmelzpunktes der DNA funktioniert die PCR nur bei hohen Temperaturen. Normale DNA-Polymerasen würden gerinnen und somit nicht funktionieren.
  • Deshalb verwendet man genetisch modifizierte Polymerasen von Thermus aquaticus (Taq-Polymerasen), die auch bei hohen Temperaturen arbeitsfähig sind. Gefunden wurde das Bakterium in heißen Quellen und ist mit seinem Stoffwechsel hervorragend an Temperaturen um die 100°C angepasst.
  • Die für die Kettenreaktion notwendige Taq-Polymerase ist somit extrem hitzebeständig und hat ein Temperaturoptimum von ca. 72°C. Sie kann Temperaturen von 95°C problemlos überstehen.

Verlauf

Denaturierung

  • Erhitzen der DNA auf 90-100°C, die DNA wird geschmolzen
  • die Einzelstränge trennen sich

Hybridisierung

  • wenn sich das Reaktionsgemisch auf 50°C abkühlt, binden die Primer mit den komplementären Sequenzen der Matrizen-DNA

Polymerisation

  • am 3´-Ende des Primers beginnt die Taq-Polymerase mit der Synthese der neuen Einzelstränge
  • bei der für die Polymerasen optimalen Temperatur von ca. 72°C arbeiten beide Enzyme fortlaufend
  • nach Beendigung der Polymerisation beginnt der Zyklus von vorn

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  • Die PCR kann so lange ablaufen, bis die in der Lösung vorhandenen Taq-Polymerasen nicht mehr ausreichen, um alle Primer zu belegen.
  • Ein Zyklus dauert wenige Minuten, wobei mehrere Zyklen vollständig automatisiert ablaufen .
  • Es können bis zu 25 Zyklen hintereinander durchgeführt werden. Vom DNA Doppelstrang liegen dann ca. 3 Millionen Kopien vor.
  • Die Länge der DNA-Moleküle ist aus technischen Gründen begrenzt.
 

Anwendungsgebiete

 

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