Wie man Gene in Bakterien überträgt
1973 war es STANLY und COHEN das erste Mal gelungen, im Reagenzglas (in vitro) DNA-Fragmente aus zwei verschiedenen Bakterienarten neu miteinander zu kombinieren und in E. coli einzuschleusen. Das Experiment gilt als Geburtsstunde der Gentechnik. Bei den DNA-Fragmenten handelte es sich um zwei Antibiotikaresistenzgene. Die veränderten E. coli – Bakterien waren nach der „Behandlung“ gegen zwei Antibiotika resistent. Zum Erschaffen neuer transgener Bakterien ist das Alltagsgeschäft von Gentechnikern: Rekombinieren – Selektieren – Klonieren – Exprimieren.
Worum gehts?
Im Folgenden werden grundlegende Arbeitsschritte dargestellt, mit denen man fremde DNA (Spender - DNA) in Zellen einzuschleusen kann, um die Gene selbst zu vermehren oder die codierten Proteine zu gewinnen.
Was muss man tun, um genveränderte Bakterien zu erzeugen?
Wie lässt sich eine erfolgreiche Genübertragung nachweisen?
Isolieren und Schneiden
Im ersten Schritt wird die sogenannte Spender-DNA (Passagier-DNA) isoliert und mittels Restriktionsenzymen geschnitten.
Gleichzeitig wird ein geeigneter Vektor (Plasmid) isoliert und mithilfe des gleichen Restriktionsenzyms geschnitten.
Das DNA-Fragment lässt sich durch drug & drop herausziehen.
Das Plasmid pBR 322 wird durch das Restriktionsenzym Pst I (1) geschnitten, so dass das passende DNA-Fragment eingebaut werden kann. Das geht nur, wenn die „klebrigen Enden“ übereinstimmen. Die Fremd-DNA muss deshalb ebenfalls mit Pst I behandelt worden sein.
- ori, Startstelle für die Replikation
- Gen für Ampicillinresistenz
- Gen für Tetracyclinresistenz
Restriktionsenzym – Schnittstellen
- Pst I
- Eco RI
- Hind III
- BamH I
Rekombinieren
Das Einfügen von Fremd-DNA in Plasmide geschieht im Reagenzglas zufällig.
Somit fügt sich nur an einigen Schnittstellen die Fremd-DNA ein, die Schnittstellen werden anschließend durch die Ligase "verklebt".
Ein erfolgreicher Einbau macht das Ampicillin-Gen inaktiv.
Bleibt der Einbau aus, dann bleibt das Ampicillin-Gen funktionsfähig. Die Ligase schließt auch hier die Lücken.
Das DNA-Fragment lässt sich durch drug & drop einbauen.
Transformieren
Die neu kombinierte DNA wird mit einem geeigneten Verfahren in die Zelle des Empfänger – Organismus eingeschleust. Bei Bakterien geschieht das in der Regel durch Transformation. Durch bestimmte Methoden wird die Zellwand und die Zellmembran durchlässiger gemacht. Das erleichtert die Aufnahme der Plasmidringe. Trotzdem wird nur bei etwa 1 von 100 000 Zellen den Vektor aufgenommen. Dabei handelt es sich um rekombinierte und nicht rekombinierte Plasmidringe.
Selektieren
Die Selektion hat das Ziel, diejenigen Zellen auszulesen, die die rekombinierten Plasmide enthalten. Hier kommen die Antibiotikaresistenzen im Plasmid zum Einsatz. Bakterien, die das nicht rekombinierte Plasmid aufgenommen haben sind resistent gegenüber Ampicillin und Tetracyclin und können somit auf Nährboden wachsen, die diese Antibiotika enthalten. Bakterien mit rekombiniertem Plasmid können nur auf einem Nährboden wachsen, der Tetracyclin enthält.
Die Selektion erfolgt in zwei Schritten:
- Im ersten Schritt wird überprüft, welche Zellen überhaupt das Plasmid aufgenommen haben.
- Im zweiten Schritt werden diejenigen Zellen selektiert, die die Fremd-DNA enthalten.
So geht’s im Detail
Als Erstes selektiert man die Zellen, die überhaupt ein Plasmid aufgenommen haben. Dazu benutzt man die Resistenz gegenüber Tetracyclin, die von rekombinierten und nicht rekombinierten Plasmiden ausgerpägt wird. Zellen ohne Plasmid können auf einem mit Tetracyclin angereicherten Nährmedium nicht überleben.
Zellen bei denen das Plasmid die Fremd-DNA enthält, haben ihre Resistenz gegenüber Ampicillin verloren. Auf dem Nährboden mit Tetracyclin haben alle tretracylinresistenten Bakterien Kolonien gebildet. Nimmt man nun einen Samtstempel und überträgt das Muster auf eine Nährkultur mit Ampicillin, dann überleben alle Bakterien, die keine Fremd-DNA enthalten.
Indem man nun die beiden Muster der Kulturen miteinander vergleicht, kann man die Kolonien mit Fremd-DNA identifizieren.
Klonieren
In der Gentechnik versteht man unter Klonieren den Einbau von Fremd-DNA in einen Vektor und die anschließende Vermehrung mit einer Wirtszelle.
In unserem Beispiel nimmt E. coli das rekombinierte Plasmid auf und vermehrt durch Zellteilung das eingebaute Gen bzw. synthetisiert das im Gen codierte Protein.
Exprimieren
In der Regel wird die Genexpression durch die Bereitstellung eines Operons (Operonmodell) kontrolliert.
Eine weitere Verwendung von transgenen Zellen ist es, Fremd-DNA in Pflanzen oder Tiere zu übertragen, um neue Eigenschaften zu erzeugen. Dann kann man z.B. bei Pflanzen aus einzelnen transgenen Zellen mehrzellige Pflanzen regenerieren. In allen Fällen entstehen Zellen mit identischer Erbinformation, die als Klone bezeichnet werden. Dementsprechend wird dieses Verfahren als Genklonierung bezeichnet.
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